Interpretação dos Princípios de Testagem RTPCR e Risco de COVID19

À medida que a pandemia de COVID-19 continua a apresentar desafios globais, o teste RT-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase com Transcriptase Reversa) continua a ser o padrão ouro para o diagnóstico da infeção por SARS-CoV-2. Mas quantos compreendem verdadeiramente os princípios científicos por trás desta ferramenta de diagnóstico crucial? Este artigo fornece uma explicação aprofundada, mas acessível, do teste RT-PCR, ajudando tanto os profissionais de saúde como o público em geral a compreender melhor esta tecnologia vital.

RT-PCR, ou Reação em Cadeia da Polimerase com Transcriptase Reversa em Tempo Real, é uma técnica de biologia molecular altamente sensível e rápida, utilizada para detetar material genético específico em amostras. Este material genético pode ter origem em humanos, bactérias ou vírus como o SARS-CoV-2.

A tecnologia central por trás da RT-PCR é a PCR, inventada por Kary B. Mullis na década de 1980 (o que lhe valeu um Prémio Nobel). A PCR amplifica e deteta alvos específicos de ADN. Melhorias posteriores permitiram a visualização e quantificação "em tempo real" dos alvos de ADN durante a amplificação. Na PCR em tempo real, a intensidade da fluorescência proveniente de sondas especializadas correlaciona-se com a quantidade de ADN amplificado.

No entanto, a PCR padrão apenas deteta ADN. Como o SARS-CoV-2 contém material genético de ARN, o teste requer a enzima transcriptase reversa para converter o ARN em ADN complementar (ADNc). Esta etapa de transcrição reversa, combinada com a PCR em tempo real, torna a RT-PCR uma ferramenta poderosa para detetar vírus de ARN como o SARS-CoV-2.

A compreensão da RT-PCR requer um conhecimento básico do material genético — o manual de instruções que rege o comportamento celular e viral, a sobrevivência e a reprodução. O material genético apresenta-se em duas formas principais: ADN (ácido desoxirribonucleico) e ARN (ácido ribonucleico). O ADN apresenta uma estrutura de dupla hélice, enquanto o ARN é de hélice simples. Para fins de diagnóstico, a maior estabilidade do ADN torna-o preferível para testes de doenças infeciosas. Notavelmente, o SARS-CoV-2 contém apenas ARN.

Todos os vírus partilham a característica de depender das células hospedeiras para a sobrevivência e replicação. O SARS-CoV-2, como outros vírus, invade células saudáveis para se reproduzir. Quando ocorre a infeção, o vírus liberta o seu ARN e sequestra a maquinaria celular para a replicação. Enquanto o material genético viral permanecer nas células, a RT-PCR pode detetar a infeção por SARS-CoV-2.

Os profissionais de saúde treinados recolhem amostras de zaragatoas nasofaríngeas, que são então colocadas em tubos estéreis contendo meio de transporte viral para preservar a integridade viral.

No laboratório, os investigadores extraem o ARN utilizando kits de purificação comerciais. A amostra de ARN é então adicionada a uma mistura de reação contendo todos os componentes necessários para o teste, incluindo polimerase de ADN, transcriptase reversa, blocos de construção de ADN e sondas e iniciadores fluorescentes específicos para SARS-CoV-2.

Como a PCR funciona apenas com modelos de ADN, a transcriptase reversa converte todo o ARN na amostra (incluindo ARN humano, bacteriano, de outros coronavírus e, potencialmente, ARN do SARS-CoV-2) em ADNc.

Este processo envolve três etapas repetidas:

• Desnaturação: Aquecer o ADN a >90°C durante cerca de 10 minutos separa o ADN de dupla hélice em cadeias simples.
• Anelamento do Iniciador: Fragmentos de ADN curtos especialmente concebidos (iniciadores) ligam-se a alvos específicos de ADNc do SARS-CoV-2 a temperaturas mais baixas. Os alvos genéticos comuns da COVID-19 incluem a polimerase de ARN dependente de ARN (RdRP), ORF1ab, gene S (proteína spike), gene N (nucleocápside) e gene E (envelope).
• Extensão: A polimerase de ADN utiliza os iniciadores como pontos de partida para criar cópias idênticas dos segmentos de ADN alvo.

O processo repete-se normalmente 40 vezes, duplicando o ADN alvo a cada ciclo. As sondas fluorescentes ligam-se a jusante dos iniciadores, libertando sinais detetáveis com cada amplificação de ADN. O aumento do ADN alvo correlaciona-se com o aumento da intensidade da fluorescência.

Os dados de fluorescência geram um valor de "Ciclo Limiar" (Ct) — o número de ciclos necessários para que o sinal exceda os níveis de fundo. As amostras com mais ADN alvo amplificam mais rapidamente, exigindo menos ciclos (valores Ct mais baixos). Por outro lado, o ADN alvo escasso requer mais ciclos (valores Ct mais altos).

Os valores Ct fornecem informações cruciais sobre a carga viral. Valores Ct mais baixos indicam quantidades mais elevadas de genoma viral, enquanto valores mais altos sugerem quantidades mais baixas. Os profissionais de saúde combinam os valores Ct com os sintomas clínicos e a história para avaliar o estádio da doença. Os valores Ct seriados de testes repetidos ajudam a monitorizar a progressão da doença e a prever a recuperação. Os rastreadores de contactos também utilizam os valores Ct para priorizar os pacientes com as cargas virais mais elevadas (e, portanto, o maior risco de transmissão).

• Carga Viral: Os valores Ct correlacionam-se inversamente com a carga viral — Ct mais baixo significa mais vírus presente.
• Estádio da Doença: A infeção precoce mostra tipicamente cargas virais elevadas (Ct baixo), enquanto os estádios posteriores mostram cargas em declínio (Ct em ascensão) à medida que o sistema imunitário elimina a infeção.
• Risco de Transmissão: Cargas virais mais elevadas (valores Ct mais baixos) indicam maior potencial de transmissão, justificando medidas de isolamento mais rigorosas.

Apesar de ser o padrão ouro de diagnóstico da COVID-19, a RT-PCR tem limitações:

• Falsos Negativos: A amostragem inadequada, as cargas virais baixas ou os testes precoces podem produzir resultados negativos, apesar da infeção real.
• Falsos Positivos: Resultados positivos raros, mas possíveis, sem infeção real.
• Desafios de Padronização: Diferentes laboratórios e plataformas podem utilizar diferentes limiares de Ct, complicando as comparações.

Os testes RT-PCR continuam a ser essenciais para o diagnóstico da COVID-19, detetando material genético do SARS-CoV-2. Os valores Ct servem como indicadores vitais da carga viral, da progressão da doença e do risco de transmissão. No entanto, as limitações dos testes exigem a combinação dos resultados com a avaliação clínica para um diagnóstico e gestão precisos.