Blogue sobre Princípios-chave e solução de problemas para kits de extração de ácido nucleico

A extração de ácido nucleico serve como base dos experimentos de biologia molecular. No entanto, quando confrontados com a enorme variedade de kits de extração comerciais disponíveis, muitos pesquisadores ficam perplexos, especialmente quando solucionam resultados inesperados. Este artigo desmistifica os princípios científicos subjacentes aos kits de extração de ácido nucleico, ao mesmo tempo que fornece orientação prática para solução de problemas para transformar esta técnica essencial de uma operação de "caixa preta" em um processo previsível e eficiente.

A maioria dos kits comerciais de extração de ácido nucleico emprega tecnologia de coluna giratória com membrana de sílica, com cinco estágios críticos: lise celular, ligação de ácido nucleico, lavagem e purificação, secagem e eluição final. Cada etapa se baseia na anterior, o que significa que qualquer passo em falso pode comprometer toda a extração.

A lise celular eficaz representa o primeiro passo crucial. As formulações de tampão de lise variam dependendo se o DNA ou RNA está sendo extraído, mas normalmente contêm altas concentrações de sais caotrópicos que servem a dois propósitos:

• Desnaturação de proteínas:Esses sais rompem as ligações de hidrogênio, as forças de van der Waals e as interações hidrofóbicas, desestabilizando proteínas (incluindo nucleases) para evitar a degradação do ácido nucleico.
• Facilitando a ligação da sílica:Os caótropos deslocam as moléculas de água dos ácidos nucléicos, criando condições ideais para transferência para as membranas de sílica.

Os sais caotrópicos comuns incluem cloridrato de guanidina, tiocianato de guanidina, uréia e perclorato de lítio. Os detergentes são frequentemente adicionados para auxiliar na solubilização de proteínas e na lise celular. Dependendo do tipo de amostra, também podem ser incorporadas enzimas. A proteinase K digere eficazmente proteínas em preparações de ácidos nucleicos, particularmente sob condições desnaturantes. A lisozima é outra enzima comum, embora sua atividade diminua sob condições desnaturantes.

A extração de plasmídeo difere significativamente do isolamento de RNA ou DNA genômico. A distinção crítica reside em primeiro separar o DNA plasmídico do DNA genômico. A adição imediata de sais caotrópicos libertaria todos os tipos de ADN indiscriminadamente. Portanto, os protocolos de plasmídeo normalmente introduzem caótropos após a lise celular inicial.

Além da lise, os sais caotrópicos facilitam a ligação do ácido nucleico às colunas de sílica. O etanol (ou às vezes o isopropanol) aumenta essa ligação. As colunas de sílica contêm resina que se liga seletivamente ao DNA ou RNA, dependendo da concentração de sal e de outros fatores. Os ácidos nucleicos resultantes exibem alta pureza adequada para clonagem, sequenciamento de leitura longa e outras aplicações.

A concentração de etanol é crítica. O excesso de etanol precipita material degradado e moléculas pequenas, afetando as leituras de absorbância do A260. Etanol insuficiente pode impedir a remoção de sal das membranas. Os volumes de etanol fornecidos pelo kit são pré-otimizados, mas se o DNA degradado parecer distorcer as leituras do A260, a reotimização da concentração de etanol pode ajudar. As soluções de fluxo podem ser guardadas para precipitação para recuperar ácidos nucleicos perdidos. Quando detergentes contendo SDS são usados ​​na lise, o NaCl serve como um precipitante eficaz que evita a contaminação do detergente.

Depois de centrifugar o lisado através de membranas de sílica, os ácidos nucleicos alvo ligam-se às colunas enquanto as proteínas e os polissacáridos permanecem em fluxo. No entanto, as membranas retêm proteínas e sais residuais. Amostras de plantas podem deixar polissacarídeos e pigmentos; amostras de sangue geralmente produzem descoloração acastanhada ou amarela. As etapas de lavagem removem esses contaminantes.

Duas lavagens são típicas, embora os números exatos dependam do tipo de amostra. A primeira lavagem geralmente contém baixas concentrações de caótropo para remover proteínas e pigmentos residuais, seguida por lavagens com etanol para eliminar sais. Amostras inicialmente com baixo teor de proteínas (por exemplo, preparações de plasmídeos ou purificação de produtos de PCR) podem exigir apenas lavagem com etanol. A remoção completa do caótropo é essencial para alto rendimento e pureza. Alguns kits recomendam lavagem dupla com etanol. Os sais residuais inibem a eluição, reduzindo os rendimentos e aumentando as leituras de A230 que deprimem as proporções A260/230.

A maioria dos protocolos inclui centrifugação pós-lavagem para secar o etanol residual das colunas. Esta etapa é crítica para eluatos limpos. A adição de tampão Tris 10 mM ou água reidrata os ácidos nucleicos para liberação da membrana. O etanol residual impede a reidratação e eluição completas. Embora o etanol não seja detectável por espectrofotometria, os sinais reveladores incluem amostras que não conseguem sedimentar nos poços de gel de agarose (mesmo com a presença de corante) ou incapacidade de congelar a -20°C.

A etapa final de extração de DNA libera ácidos nucléicos puros da sílica. Para DNA, Tris 10 mM em pH 8-9 é padrão. O DNA permanece mais estável em pH fracamente alcalino e se dissolve mais rapidamente em tampão do que em água. Até mesmo os precipitados de DNA se comportam de maneira semelhante. A água normalmente exibe pH mais baixo (4-5) e o DNA de alto peso molecular pode não ser totalmente reidratado rapidamente. Para recuperação máxima de DNA, deixe o tampão assentar nas membranas por vários minutos antes da centrifugação. Para aplicações que exigem DNA intacto de alto peso molecular (por exemplo, sequenciamento de leitura longa), os tampões de eluição são ideais. O RNA tolera pH fracamente ácido e se dissolve facilmente em água, tornando a água o diluente preferido.

Mesmo seguindo protocolos padrão, as extrações podem encontrar vários problemas:

• Baixo rendimento:Muitas vezes decorre de lise incompleta ou condições de ligação abaixo do ideal. Sempre use etanol anidro fresco e de alta qualidade para diluição do tampão e etapas de ligação. O etanol de baixa qualidade ou antigo pode absorver umidade, alterando as concentrações de trabalho. Lembre-se: os tampões de lavagem preparados incorretamente podem remover os ácidos nucleicos extraídos!
• Baixa pureza:A contaminação por proteínas geralmente resulta do excesso de material de partida, aumentando o risco de dissolução incompleta. Razões baixas de A260/230 normalmente indicam sais residuais ou lavagem insuficiente. Use etanol da mais alta qualidade para tampões de lavagem e, se os problemas persistirem, adicione etapas extras de lavagem.
• Contaminantes:As amostras ambientais revelam-se particularmente suscetíveis a substâncias húmicas que co-purificam com o DNA e resistem à remoção da coluna de sílica. Técnicas especializadas podem remover proteínas e húmicos interferentes antes da ligação da coluna.
• Degradação:O RNA enfrenta maiores riscos de degradação, normalmente devido ao armazenamento inadequado de amostras ou lise ineficiente (assumindo que seja usada água livre de RNase). Para o DNA, a degradação é menos importante para aplicações de PCR, mas torna-se crítica para sequenciamento de leitura longa que requer DNA intacto de alto peso molecular – evite lise mecânica excessiva!
• Purificação do produto PCR:Embora não seja estritamente extração de DNA, isso merece menção. Normalmente, 3-5 volumes de solução salina são adicionados por volume de reação de PCR antes da purificação da coluna giratória. As purificações que falharam geralmente resultam de falha na PCR, mas é aconselhável economizar no fluxo – se as bandas de PCR claras não se ligarem às colunas, elas provavelmente permanecerão no fluxo para recuperação e repurificação.

A lise incompleta pode manifestar-se como rendimentos inesperadamente baixos, dissolução incompleta de proteínas ou proporções pobres de A260/230. Isto sugere que certos componentes da amostra não conseguiram lisar ou dissolver completamente durante a extração. Distinguir a lise incompleta da contaminação ou degradação requer uma análise cuidadosa das condições de extração, incluindo a composição do tampão de lise, parâmetros de incubação e possíveis substâncias interferentes. Por exemplo, proporções fracas de A260/230 podem indicar sais residuais pós-ligação ou lavagem insuficiente, em vez de lise incompleta. Lidar com a lise incompleta pode exigir a otimização dos componentes do tampão de lise, dos tempos de incubação ou da incorporação de métodos adicionais de lise mecânica/enzimática.

Técnicas especializadas visam a remoção de substâncias húmicas e outros interferentes que podem co-purificar com ácidos nucleicos de amostras ambientais. Estes incluem tampões de extração especializados contendo agentes quelantes (por exemplo, EDTA) para ligar e remover seletivamente cátions. Métodos de pré-tratamento, como centrifugação diferencial ou filtração, podem ajudar a remover partículas maiores de amostras ambientais antes da extração de ácidos nucleicos, reduzindo a interferência durante as etapas de ligação.

Certas amostras (por exemplo, tecidos ou materiais ricos em lipídios) apresentam desafios específicos. As amostras de tecido muitas vezes requerem ruptura mecânica adicional ou digestão enzimática para garantir a lise completa e a liberação de ácido nucleico. Amostras ricas em lipídios podem complicar a purificação, pois os lipídios podem interferir na ligação do ácido nucleico às matrizes da coluna. Enfrentar esses desafios pode exigir a modificação da composição do tampão de lise, a otimização dos protocolos de purificação ou o uso de kits especialmente projetados.

Publicado originalmente em 28 de junho de 2010. Revisado e republicado em maio de 2021 e março de 2024.